Morfologia hodowli autologicznego nabłonka rogówki

Wstęp
Cel: Chirurgia, której podstawą jest hodowany nabłonek rogówki, to obiecująca metoda rekonstrukcji powierzchni oka. Celem badania jest ocena morfologii i cech fenotypowych hodowli pod kątem jej przydatności do przeszczepu.

Materiał i metody
Hodowlę nabłonka prowadzono u 25 pacjentów z niewydolnością rąbka spowodowaną oparzeniem chemicznym lub termicznym. Rąbek drugiego oka stanowił źródło komórek rąbka rogówki do hodowli nabłonka rogówkowego. Komórki nabłonka rąbkowego z 2 mm2 biopsji rąbka po trypsynizacji wysiewane były na podłoże z błony owodniowej i hodowane w standardowych warunkach w zmodyfikowanym DMEM/HAM F12 w obecności fibroblastów linii 3T3. W mikroskopii świetlnej oceniano regularność nabłonka, a techniką histologiczną – liczbę warstw komórek. Barwienie immunocytochemiczne stosowano w celu oceny pochodzenia nabłonka i jego potencjału proliferacyjnego. Barwienia wykonano w kierunku cytokeratyn 3., 12., 19., koneksyny 43. i białka p63.

Wyniki
Przeprowadzono 27 hodowli nabłonka u 25 dawców. Dwie hodowle zdyskwalifikowano z powodu infekcji, a następnie powtórzono. W 84% przypadkach uzyskano regularny, warstwowy wzrost nabłonka rogówkowego. W 16% hodowli wzrost był nieregularny ze zmienną liczbą warstw komórek. We wszystkich hodowlach barwienie w kierunku cytokeratyn 3. i 12. Potwierdziło rogówkowe pochodzenie nabłonka. Liczba warstw komórek wyniosła od 3 do 9, średnio 5,3 ± 1,9.

Wnioski
Hodowla nabłonka rogówki jest wartościowym źródłem tkanki dla odtworzenia nabłonka rogówkowego.



Introduction
Purpose: Ocular surgery based on cultivated corneal epithelium has become a very promising procedure eligible to restore the ocular surface. Analysis of morphologic features and the phenotype of cultivated epithelial cells determines their quality and eligibility of transplantation.

Material and methods
Corneal epithelial cultures were carried out in 25 patients suffering from limbal deficiency after chemical or thermal burns. Fellow healthy eyes were the source of limbal epithelium for the culture. Limbal cells from a 2 mm2 biopsy were seeded on an amniotic membrane after enzymatic pretreatment. Cultures were carried in standard conditions in a supplemented DMEM HAM/F12 medium in the presence of 3T3 fibroblasts. Light microscopy was used to analyze the regularity of the cultivated epithelial layer, histologic examination was used to establish number of epithelial layers, and immunohistochemistry for epithelial and proliferation markers was applied to confirm cell origin and proliferative potential. Staining for cytokeratin 3, 12, 19, connexin 43, and protein p63 was performed.

Results
In 25 donors, 27 cultures of the epithelium were performed. In 2 cases, plates were contaminated. Both cultures were repeated. In 84% of the cultures, regular stratified growth of the epithelium with complete covering of amniotic membrane was observed. In 16% of cultures, growth was not regular, showing differences in the number of cell layers. Staining for cytokeratin 3/12 confirmed the corneal origin of cultivated epithelia. The number of epithelial layers ranged from 3 to 9; the average was 5.3 ± 1.9 layers.

Conclusions
Cultures of limbal epithelial cells are a valuable source of tissue for restoration of the corneal epithelium.